тесты и допинг-контроль пептидных гормонов

doping

Методы количественной оценки содержания пептидных гормонов в биологических жидкостях представляют собой базовую потребность для прикладных медицинских и биомедицинских исследований в области эндокринологии. В идеале такие методы должны обладать высокой специфичностью и позволять точно идентифицировать и оценивать количество интересующего исследователя гормона, избегая помех со стороны похожих пептидных молекул или других биологических веществ. Они должны быть чувствительными настолько, чтобы позволять детектировать пептидные гормоны при естественных низких концентрациях, наблюдаемых в физиологически нормальных и патофизиологических ситуациях. Обычно концентрация гормонов в крови колеблется в пределах нано- или пикомолей, что придает чувствительности метода решающее значение. Наконец, методы определения должны быть простыми и быстрыми, позволяя обрабатывать большие серии образцов за разумное время. Такие методологические аспекты определения гормонов приобретают еще большее значение, когда анализы выполняются в рамках системы контроля применения допинговых препаратов в спорте. Учитывая возможные серьезные последствия для спортсмена, затрагиваемые финансовые и политические интересы, а также потенциальные этические и юридические проблемы, уровень точности, специфичности и надежности методов определения гормонов в этой области должен быть чрезвычайно высоким. Например, для коммерческих наборов для анализа, часто используемых в клинической практике, очень редко указывается кросс-реактивность специфических молекулярных изоформ пептидных гормонов, тогда как эта характеристика имеет критическое значение в случае проведения допинг-контроля на наличие веществ, описываемых ниже (хорионический гонадотропин [hCG], эритропоэтин [ЕРО], гормон роста человека [hGH]). Наконец, во время проведения соревнований часто приходится проводить крупномасштабный анализ образцов за короткий промежуток времени, что также обостряет потребность в быстрых методах анализа.

За последние 30 лет в разработке аналитических методов количественного определения пептидных гормонов был достигнут значительный прогресс, который позволил выполнить упомянутые выше требования. Однако, начиная со времени зарождения радио-иммунологического анализа и заканчивая последними разработками методов масс-спектрометрии, остается знание недостатков и ограничений каждого метода, при наличии которого можно избежать неверной интерпретации полученных данных. В некоторых случаях один метод просто не позволяет одновременно добиться выполнения нескольких целей. Например, нет никаких сомнений в том, что масс-спектрометрия является единственным методом, позволяющим с чрезвычайно высокой степенью точности идентифицировать молекулы химического вещества (Binz et al., 2003; Gam et al., 2003; Kast et al., 2003). Однако современные методы масс-спектрометрии по-прежнему остаются сложными, требуют значительного времени для проведения анализа и в некоторых случаях очень сложной подготовки образца. Прогресс, который был достигнут в применении техники масс-спектрометрии для анализа очищенных препаратов пептидных гормонов, не сопровождался аналогичным развитием подходов исследования смесей гормонов в более сложных биологических образцах, например в сыворотке (Liu, Bowers, 1997; Black, Bowers, 2000; Wu S.L. et al., 2002), а высокая степень точности анализа, которая достигается в оптимальных условиях, отнюдь не означает, что масс-спектрометрия полностью исключает возможность ошибки (Annesley, 2003). Наконец, стоимость необходимого для данного метода оборудования все еще остается гораздо более высокой по сравнению с иммунологическими методами определения гормонов. Быстрое развитие новых методов в области масс-спектрометрии наряду с разработкой приборов, предназначенных для высокопроизводительного анализа, внедрением автоматизированных систем подготовки образцов, а также увеличение чувствительности, недавно достигнутое рядом исследователей, может существенно изменить положение в будущем (см. обзор Binz et al., 2003). Однако сегодня основная масса анализов гормонов в клинике и исследовательской работе проводится “традиционными методами иммуноанализа, поэтому в этой статье основное внимание будет уделено потенциальным возможностям и ошибкам определения пептидных гормонов методами иммунноанализа.

Общие аспекты применения методов иммуноанализа[]

В иммуноанализе используется уникальная способность специфических иммуноглобулинов (антител) узнавать и связывать определенные трехмерные структуры на поверхности молекулы (так называемые “эпитопы”). Взаимодействие антиген—антитело характеризуется высокой степенью специфичности. Использование мощных метящих веществ для антител или гормонов позволяет значительно расширить динамический диапазон применения иммуноанализа. Традиционно в качестве системы детекции при проведении анализа гормонов использовали радиоактивные изотопы. Однако экологические и экономические аспекты их использования, а также вред для здоровья стимулировали разработку различных неизотопных методов детекции. В этих новых системах для детекции сигнала используют либо ферментативную колориметрическую или хемилюминесцентную реакцию, либо — в качестве альтернативы — флуоресцентный краситель. Среди преимуществ неизотопных методов детекции — стабильность метящего вещества, поскольку радиоактивная метка со временем подвергается распаду и это обусловливает значительную вариабельность результатов при использовании различных партии радиоактивного вещества. В отдельных случаях современные неизотопные системы детекции сигнала превосходят по чувствительности радиоактивную метку, что еще больше увеличивает их привлекательность. Однако в целом чувствительность метода иммуноанализа зависит преимущественно от степени сродства используемых специфических антител и часто выбор того или иного типа метки определяется только наличием в исследовательской лаборатории определенных приспособлений для ее количественной оценки.

Технические аспекты применения методов иммуноанализа и их последствия[]

С методологической точки зрения приемы иммуноанализа могут быть разделены на две основные подгруппы: классический “конкурентный” иммуноанализ и “сэндвич-анализ» . В случае “конкурентного” иммуноанализа гормон, присутствующий в образце, “конкурирует” за связывание с антителами с меченой формой того же гормона, добавленного в реакционную смесь. Чем выше концентрация эндогенного гормона, тем ниже вероятность связывания с антителом меченой молекулы гормона, т. е. величина сигнала, получаемого в ходе анализа, обратно пропорциональна содержанию гормона в образце. В зависимости от типа используемой метки методы конкурентного анализа называются радиоиммунологическим анализом (RIA), иммуноферментным анализом (ИФА или EIA), люминесцентным иммуноанализом (LIA) или флуоресцентным иммуноанализом (FIA). С другой стороны, в случае “сэндвич-иммуноанализа” в реакционной смеси находятся иммобилизованные антитела, которые связывают гормон из образца, а также меченые детектирующие антитела, которые взаимодействуют с другим эпитопом на поверхности молекулы гормона, что позволяет визуализировать молекулы гормона, связавшиеся с иммобилизованными антителами: чем больше количество гормона связывается с иммобилизованными антителами, тем выше интенсивность сигнала, который дают связавшиеся с ним меченые антитела. Таким образом, величина детектируемого сигнала прямо пропорциональна количеству гормона, содержащегося в образце. Как и в случае упоминавшейся выше номенклатуры конкурентного иммуноанализа, названия разновидностей “сэндвич-анализа” происходят от типа используемой системы детекции: радиоизотопный метод (radioimmunometric assay (IRMA)), иммуноферментный (enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)), люминесцентный (luminometric assay (ILMA)) и флуоресцентный (fluorometric assay (IFMA)).

Различия в технике выполнения конкурентного иммуноанализа и “сэндвич-иммуноанализа” определяют возможности их применения и особенности интерпретации результатов. Тогда как для проведения конкурентного иммуноанализа требуется только одно антитело и, соответственно, один эпитоп, для “сэндвич-аиализа” необходимы два антитела и два различных эпитопа. Эти эпитопы должны быть пространственно разобщены, поскольку в ином случае связывание с иммобилизованным антителом будет препятствовать связыванию с мечеными антителами, используемыми для детекции, следовательно, “сэндвич-метод” применим только в случае “крупных” молекул и может быть использован для определения больших пептидных гормонов, таких, как инсулин, соматотропный гормон (СТГ) или (ЕРО). В то же время небольшие пептиды (адренокортикотропный гормон (АКТГ), кортиколиберин, соматолиберин и стероидные гормоны часто определяются с использованием конкурентного иммуноанализа. Преимущество “сэндвич-иммуноанализа” заключается в том, что для узнавания молекулы гормона требуется наличие двух независимых эпитопов, и это делает метод, по крайней мере теоретически, более специфическим и менее подверженным ошибкам, обусловленным кросс-реактивностью пептидов, имеющих похожую структуру. Кроме того, в этом случае анализируемый гормон и гормон, используемый в качестве стандарта или для калибровки системы, химически идентичны, тогда как в конкурентном иммуноанализе используемый в качестве стандарта гормон является химически модифицированным за счет связывания метки. Подобная модификация может приводить к возникновению различий в сродстве антител к естественному гормону, содержащемуся в образце, и модифицированному гормону, используемому в случае проведения анализа как конкурента.

Стандартизация иммуноанализа[

Важно отметить, что все методы иммуноанализа являются “относительными” по своей сущности. Это означает, что концентрация интересующего нас вещества в образце оценивается по сравнению с концентрацией стандарта, точнее концентрация оценивается путем сравнения способности используемых антител связываться с гормоном в биологическом образце (например, в сыворотке пациента) и в образце стандарта соответственно. С точки зрения теории в основе такой техники количественного анализа лежат три фундаментальных допущения: 1) стандарт идентичен по своим физико-химическим свойствам и трехмерной структуре с интересующим нас веществом; 2) эпитопы на поверхности интересующей нас молекулы свободно доступны антителам как в биологическом образце, так и в образце стандарта; 3) вещество в образце стандарта и исследуемом образце находится в одинаковых условиях (одном и том же рабочем растворе). Очевидно, что реализовать все эти три допущения при анализе пептидных гормонов достаточно сложно. Для одних веществ не существует международных стандартных образцов (international reference preparation, IRP), для других имеется по несколько стандартных образцов. Так, например, для соматотропного гормона человека IRP 80/505 получен из экстракта гипофиза, a IRP 88/624 и IRP 98/574 представляют собой рекомбинантные белки. Кроме того, некоторые стандартные образцы имеют очень низкое качество и невысокую степень чистоты (например, IRP инсулиноподобного фактора роста I (ИФР-1) содержит всего 40 % ИФРТ (Quarmby et al., 1998)). Еще более осложняет ситуацию то, что многие природные гормоны в организме человека представлены смесью разнообразных изоформ, а не однотипными молекулами (Nagy et al., 1994). Этот факт был продемонстрировал достаточно детально, в частности для кортикотропного гормона человека (Birken et al., 2003; Lottersberger et al., 2003), а также соматотропного гормона человека (Baumann, 1999; Boguszewsky, 2003). Выбор конкретной изоформы или смеси изоформ, которые могут быть использованы как стандартный образец, будет в значительной мере определяться конкретной задачей, которую пытаются решить исследователь или врач при определении концентрации гормона. В 1991 г. Роджер Экинс, один из создателей метода иммуноанализа, писал, что стандартизация иммуноанализа для гетерогенного по составу антигена невозможна (Ekins, 1991), и непрекращающаяся дискуссия по вопросу стандартизации количественной оценки явно демонстрирует, что мы еще достаточно далеки от момента достижения консенсуса (Roger, Lalhou, 1994; Quarmby et al., 1998; Ranke et al., 2001).

Что касается второго допущения, следует иметь в виду, что для многих пептидных гормонов в системе кровообращения можно найти ряд естественных “связывающих белков”, обладающих большим или меньшим сродством (Baumann et al., 1988). Присутствуя в образце, эти связывающие белки могут затруднять количественную оценку гормона либо за счет связывания молекул конкурентного меченого пептида, либо препятствуя взаимодействию гормона с антителами (Fisker, Orskov, 1996). В зависимости от метода иммуноанализа наличие связывающих белков в анализируемом образце может приводить к завышенным или заниженным оценкам концентрации гормона. Источником ошибки, не имеющим никакого отношения к анализируемому гормону, могут стать также присутствующие в образце гетерофильные антитела] Такие антитела могут связываться одновременно с иммобилизованными и мечеными антителами, что приведет к усилению сигнала и завышенной оценке гормона (Kricka, 1999). Было показано, что образование таких антител может происходить у лиц, которые держат домашних животных (Park et al., 2003), однако точная причина их появления остается неизвестной. Была предпринята попытка разработки модифицированных методик, которые бы позволили избежать подобных ошибок, однако проблема по-прежнему окончательно не решена (Emerson et al. 2003; Preissner ct al., 2003). Наконец, буферная смесь, используемая для приготовления стандартного раствора, редко является идентичной сыворотке человека — в большинстве случаев для этой цели используют сыворотку животного происхождения или буфера, в состав которых включен альбумин. В некоторых случаях компоненты буферной смеси могут оказывать влияние на повеление антител, что также будет приводить к возникновению различий при проведении анализа с использованием растворов стандартных образцов различного состава.

Поскольку все упомянутые выше факторы могут оказывать заметное влияние на результаты количественного анализа гормона, необходимо очень внимательно интерпретировать данные, полученные методом иммуноанализа. Каждый метод должен оцениваться с точки зрения возможности перекрестного взаимодействия между используемыми в ходе анализа веществами, в идеальном случае желательно иметь точную характеристику эпитопа, распознаваемого антителами. Очевидно, что каждая разновидность иммуноанализа будет иметь свои особенности зависимости величины сигнала от концентрации того или иного гормона (Strasbuiger et al., 1996, 2001; Stenman et al., 1997; Quarmby et al., 1998; Wood, 2001: Sharpe et al., 2002), поэтому следует избегать простых ссылок на «общеизвестные» нормативные данные, представленные в руководствах. Наконец, как и раньше, остается актуальной потребность создания IRP для многих пептидных гормонов. Как недавно было показано для хорионического гонадотропина (hCG) (Birken et al., 2003), разработка стандартных образцов является достаточно сложной задачей, которая вместе с тем помогает исключить некоторые причины, вносящие неопределенность в результаты иммуноанализа.